滲透壓對谷氨酸棒桿菌葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和高產(chǎn)谷氨酸的影響

摘要：谷氨酸棒桿菌對葡萄糖的攝取主要通過對葡萄糖具有高親和力(Km=0.35 mM)的甘露糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)。選擇能夠耐受2-脫氧葡萄糖(2DG)和缺乏PEP依賴的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性的突變體，這些突變體能夠在以葡萄糖為唯一碳源和能源的培養(yǎng)基上生長，由于采用的是低親和力(Ks=11 mM)的非PTS攝取系統(tǒng)，所以攝糖速率顯著降低。在不同滲透壓的培養(yǎng)基中生長，野生型細(xì)胞比葡萄糖消耗速率和比生長速率降低。當(dāng)這些培養(yǎng)物的細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)條件下測量時顯示具有相似的PTS活性。然而，當(dāng)細(xì)胞重新懸浮在不同滲透壓的緩沖液中時，PTS活性顯示與滲透壓相關(guān)。這種抑制效應(yīng)能夠解釋在高滲透壓發(fā)酵培養(yǎng)基中觀察到的糖吸收和生長速率下降的原因。但是非PTS葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)不受培養(yǎng)基滲透壓的影響。在工業(yè)生產(chǎn)條件下隨著谷氨酸積累培養(yǎng)基滲透壓相應(yīng)增加，觀察到對糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力的類似抑制。這種現(xiàn)象從而限制了發(fā)酵過程，因?yàn)楸人俾实慕档蜁䦟?dǎo)致細(xì)胞維持而消耗的糖比例增加，同時伴隨著產(chǎn)品產(chǎn)率的降低。

關(guān)鍵詞：葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)；滲透壓；谷氨酸發(fā)酵；谷氨酸棒桿菌；

研究內(nèi)容：

1、滲透壓對PTS葡萄糖攝取系統(tǒng)活力的影響

滲透壓800mOsmol/Kg以內(nèi)PTS活性維持恒定，之后隨著滲透壓升高PTS活性線性下降。滲透壓1900mOsmol/Kg時PTS活性只有最高時的15%。

2、滲透壓對谷氨酸發(fā)酵的影響

谷氨酸和次級代謝產(chǎn)物的積累會引起培養(yǎng)基滲透壓的顯著增加，為了維持pH值恒定，堿(在本例中為氨)的加入進(jìn)一步加劇了滲透壓的增加。在谷氨酸棒狀桿菌溫度敏感菌株2262中觀察到這一現(xiàn)象，該菌株能夠達(dá)到高產(chǎn)物濃度(谷氨酸>85g/L)并且滲透壓超過2000 mOsmol·kg-1。在最初幾個小時內(nèi)糖的消耗率保持不變，然后逐漸下降。為了檢驗(yàn)活性減弱是否與谷氨酸累積導(dǎo)致的滲透壓增加相關(guān)，測量了PTS活性對總糖攝取量的貢獻(xiàn)，在野生菌谷氨酸棒狀桿菌ATCC 17965中測量的貢獻(xiàn)一致，即4.5 mmol·g-1·h-1。在谷氨酸生產(chǎn)菌株中，總糖攝取更快，表明滲透酶活性更高。在非脅迫條件下測得的葡萄糖攝取速率表明在谷氨酸棒狀桿菌2262中滲透酶貢獻(xiàn)高達(dá)25%的總葡萄糖攝取量。按照PTS轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的體外測量方法測定滲透應(yīng)激對PTS活性的抑制影響，在葡萄糖補(bǔ)料條件下(滲透酶的貢獻(xiàn)可以忽略不計)(低殘留葡萄糖，即小于2g·l-1)，可以看到葡萄糖消耗量的下降與預(yù)測的PTS活性下降非常接近(圖3a)。當(dāng)采用維持較高濃度的葡萄糖補(bǔ)料策略（50 g·l-1），葡萄糖消耗有改善可能是由于滲透酶活性和反應(yīng)器中存在的葡萄糖對該系統(tǒng)的飽和度高(圖3b)。在這種條件下，高葡萄糖消耗率導(dǎo)致額外代謝物的較早出現(xiàn)，如乳酸。

3、對谷氨酸產(chǎn)率的影響

一旦培養(yǎng)基中的滲透壓增加，代謝活性下降的后果之一是發(fā)酵結(jié)束時谷氨酸產(chǎn)量顯著降低。葡萄糖消耗率的下降會引起谷氨酸產(chǎn)率的下降，這是由于轉(zhuǎn)化為CO2的葡萄糖比例增加。在整個生產(chǎn)階段CO2產(chǎn)量大致保持恒定，這表明從糖分解代謝中獲得生化能量來滿足細(xì)胞維持的需求恒定，這種需求與發(fā)酵罐內(nèi)的生物量成比例，因此糖比消耗速率的降低需要增加所用糖的比例。當(dāng)使用谷氨酸棒狀桿菌的維持系數(shù)0.6mmol葡萄糖/g細(xì)胞/h計算，用于細(xì)胞維持需要的葡萄糖的比例從谷氨酸生產(chǎn)的初始階段總糖消耗的15%增加到發(fā)酵后期滲透壓最高時的40%(圖4)。在發(fā)酵后期觀察到的谷氨酸產(chǎn)率下降與維持需求的碳代謝流的變化一致。根據(jù)代謝活性減弱期間代謝需氧量降低，則根據(jù)氧變化控制殘?zhí)菨舛瓤赡芑謴?fù)部分產(chǎn)率損失。

4.討論

本文說明了谷氨酸發(fā)酵后期的抑制與產(chǎn)物積累和滲透環(huán)境對糖吸收能力的控制影響直接相關(guān)。這種現(xiàn)象不是由于基因表達(dá)水平的變化，而是由于滲透脅迫條件下轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的生化活性發(fā)生了改變。此外，這種效應(yīng)是可逆的，因?yàn)橐坏B透脅迫被消除，被洗滌的細(xì)胞仍能恢復(fù)其轉(zhuǎn)運(yùn)糖的能力。同樣，當(dāng)重懸于高滲的緩沖液中時，正常生長的細(xì)胞糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力也顯著降低。

隨著滲透壓的增加，這種生理效應(yīng)會導(dǎo)致耗糖能力下降和代謝速率減慢。由于維持生物量的能量要求保持不變，而且在許多情況下會需要增加額外能量以滿足對抗此類壓力，這也將導(dǎo)致產(chǎn)品產(chǎn)率下降。越來越多的糖消耗將用于能源生產(chǎn)，因此會以減少產(chǎn)品為代價，以二氧化碳的形式損失掉。對于谷氨酸發(fā)酵，隨著培養(yǎng)基滲透壓的增加，產(chǎn)量和產(chǎn)率均顯著降低。引發(fā)PTS蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)能力下降的生化機(jī)制仍有待確定，但可能與蛋白/膜復(fù)合體的結(jié)構(gòu)變化相關(guān)。

更高效或更快速地生產(chǎn)谷氨酸的菌株達(dá)到滲透閾值將更快，這將導(dǎo)致發(fā)酵24小時后可能產(chǎn)量不會提高。因此，篩選具有高耐壓能力的菌株對發(fā)酵是有益的，從而確保工業(yè)菌株足夠健壯，在獲得高產(chǎn)物產(chǎn)量時能維持高代謝活性。另一條克服這種代謝抑制的路徑則是開發(fā)一種發(fā)酵系統(tǒng)，能夠整合下游提取過程在發(fā)酵積累時去除產(chǎn)物。