滲透壓對(duì)CHO細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞體積、抗體產(chǎn)率及糖基化的影響

1、介紹

中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO）細(xì)胞的培養(yǎng)滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）和細(xì)胞體積與特定的重組蛋白生產(chǎn)力相關(guān)，生物合成能力和營(yíng)養(yǎng)交換取決于細(xì)胞大小，而細(xì)胞大小又受到培養(yǎng)物滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）的影響，已知高滲條件會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞體積增加。

細(xì)胞大小是特定蛋白質(zhì)生產(chǎn)力的決定因素。盡管每個(gè)細(xì)胞周期階段的細(xì)胞都具有生產(chǎn)力，但G2/M期的細(xì)胞表現(xiàn)出最高的生產(chǎn)力。
在某些研究中，滴度的增加伴隨著蛋白質(zhì)質(zhì)量的變化，特別是在糖基化方面，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)高滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）可以降低Fc融合蛋白的N-糖中酸性異構(gòu)體和唾液酸含量的比例，這可以通過添加甜菜堿來避免。
同樣，在補(bǔ)料分批培養(yǎng)階段，滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）濃度增加60-120mOsm/kg會(huì)導(dǎo)致未充分加工的聚糖的分泌。

2、結(jié)果和討論

一、高滲透壓對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝的影響

圖1：中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO）細(xì)胞的最大生長(zhǎng)速率與細(xì)胞外滲透壓的函數(shù)關(guān)系。

我們?cè)诮臃N前向培養(yǎng)基中加入NaCl或補(bǔ)料C，以獲得320至500 mOsm kg?1之間的初始滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）值。如圖1所示，在這兩種情況下，滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）的增加導(dǎo)致最大特定細(xì)胞生長(zhǎng)率顯著降低。兩種處理方式的最大生長(zhǎng)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。

不同滲透壓條件下細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)隨時(shí)間的變化曲線

活細(xì)胞密度曲線如圖2A所示隨著鹽或補(bǔ)料的添加滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）濃度增加，生長(zhǎng)速率明顯降低。這些發(fā)現(xiàn)表明，添加補(bǔ)料會(huì)嚴(yán)重抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，在（添加補(bǔ)料C）滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）達(dá)到500 mOsm kg?1的情況下可以清楚地看到這一點(diǎn)。在培養(yǎng)過程中，滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）值增加（圖2B），主要是由于細(xì)胞外乳酸、Na+和K+的積累（圖2，分別為E、G和H）。

直到第5天，平均細(xì)胞直徑與滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）呈正相關(guān)（圖2C），其值在接種后24小時(shí)快速增加，特別是對(duì)于添加補(bǔ)料C超過410 mOsm kg?1與對(duì)照組相比非常明顯。然而，從第6天開始，當(dāng)對(duì)照和添加NaCl的培養(yǎng)物中的葡萄糖和谷氨酸等關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)開始耗盡時(shí)，趨勢(shì)發(fā)生了變化（圖2F、2I）。

氨濃度(圖2D)呈逐漸增加的趨勢(shì)，但只有3種條件超過5mM，對(duì)該細(xì)胞系[36]有明顯的抑制作用。然而，在所有情況下，這一閾值是在靜止期或后期培養(yǎng)，很可能不損害達(dá)到高峰細(xì)胞密度。圖2E，F分別顯示細(xì)胞外乳酸菌和葡萄糖的分布，其中前者從產(chǎn)生到消耗的轉(zhuǎn)變僅在對(duì)照和320mOsmkg-1條件下進(jìn)行。其余的培養(yǎng)物在整個(gè)培養(yǎng)過程中表現(xiàn)出持續(xù)的乳酸產(chǎn)生，在一些添加NaCl的培養(yǎng)物中，乳酸似乎來自葡萄糖以外的其他來源。從乳酸產(chǎn)生到消耗的轉(zhuǎn)變被認(rèn)為取決于培養(yǎng)液的pH值。

圖3 不同滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）條件下（A）氨、（B）葡萄糖、（c）谷氨酸、（D）谷氨酰胺和（E）乳酸的特定攝取/產(chǎn)生速率。對(duì)照培養(yǎng)物未產(chǎn)生可檢測(cè)水平的谷氨酰胺。誤差條表示兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。對(duì)于顯著性分析（*p<0.05），假設(shè)不同實(shí)驗(yàn)之間每個(gè)變量的方差相等.

圖3顯示了指數(shù)生長(zhǎng)階段（即根據(jù)第0天至第6天的數(shù)據(jù)計(jì)算）我們觀察到了恒定的滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）值。與對(duì)照組相比，所有培養(yǎng)物的特定葡萄糖消耗率都較高，盡管表現(xiàn)出較低的特定細(xì)胞生長(zhǎng)率。無論隨后的高滲處理如何，隨著滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）的增加，葡萄糖上的乳酸產(chǎn)量都更高，這表明無論誘導(dǎo)方法如何，碳代謝都不充分。先前已經(jīng)報(bào)道，在較高的殘留葡萄糖濃度下，葡萄糖上的乳酸產(chǎn)量增加。事實(shí)上，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果指向相同的表型。比較使用相同誘導(dǎo)方法的培養(yǎng)物之間的殘留葡萄糖濃度（圖2F），我們發(fā)現(xiàn)葡萄糖濃度越高，在細(xì)胞生長(zhǎng)期（兩天的初始適應(yīng)期，隨后是指數(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)）內(nèi)乳酸的產(chǎn)生率就越高（圖3E）。這種行為在培養(yǎng)后期仍在繼續(xù)，在正常滲透壓條件下（對(duì)照和370mOsm kg?1 NaCl）的兩種培養(yǎng)物顯示出乳酸濃度的快速下降，這是由于細(xì)胞將代謝產(chǎn)物作為碳源重新內(nèi)化所致（圖2E）。在加入NaCl的最高滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）培養(yǎng)物的情況下，產(chǎn)生的乳酸鹽的一部分似乎來自糖酵解以外的來源。先前有報(bào)道稱，谷氨酸解酶可以在癌癥細(xì)胞中提供碳和氮，已知這些細(xì)胞與CHO細(xì)胞具有相似的代謝特征。有趣的是，當(dāng)滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）值在410-420mOsm kg?1范圍內(nèi)時(shí)，在兩種高滲誘導(dǎo)策略下，氨的產(chǎn)生率沒有顯著差異。然而，這種變化在460–470 mOsm kg?1范圍內(nèi)，其中NaCl培養(yǎng)物表現(xiàn)出顯著更高的氨生成率（p<0.05）。具體而言，添加NaCl的培養(yǎng)物比添加補(bǔ)料C的實(shí)驗(yàn)分泌更多的氨（圖3A）。這與各自的谷氨酰胺生產(chǎn)速率一致，后者使用氨合成和分泌谷氨酰胺的速率高于前者（圖3D）。然而，谷氨酸的攝取/生產(chǎn)速率并不遵循相同的模式，460–470 mOsm kg?1范圍內(nèi)的NaCl培養(yǎng)物消耗谷氨酸，而補(bǔ)料C培養(yǎng)物分泌谷氨酸。鑒于補(bǔ)料C富含氨基酸，我們假設(shè)這些培養(yǎng)物將其他氨基酸轉(zhuǎn)化為谷氨酸，然后用于合成谷氨酰胺。有趣的是，500 mOsm kg?1的培養(yǎng)物表現(xiàn)不同，表現(xiàn)出氨和谷氨酸產(chǎn)量增加，谷氨酰胺分泌減少，表明在這些高滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）、營(yíng)養(yǎng)豐富的條件下有不同的代謝途徑。

二、高滲壓對(duì)滴度和特異性抗體生產(chǎn)率及糖基化的影響

圖4顯示了所有培養(yǎng)物收獲時(shí)的mAb滴度和各自的整體活細(xì)胞密度（IVCD）值。最高滴度為410 mOsm kg?1，添加補(bǔ)料C也顯示出最高的IVCD，盡管后者與對(duì)照培養(yǎng)物沒有顯著差異。在另一端，500 mOsm kg?1補(bǔ)料C培養(yǎng)物的IVCD和mAb滴度最低�？偟膩碚f，滴度大致遵循與IVCD相同的趨勢(shì)，470 mOsm kg?1 NaCl培養(yǎng)物除外。從圖5中的特定mAb生產(chǎn)力我們可以看到，在所有條件下，470 mOsm kg?1 NaCl培養(yǎng)物的mAb分泌率最高。這不僅高于對(duì)照培養(yǎng)物，而且明顯高于所有添加補(bǔ)料C培養(yǎng)物。有趣的是，補(bǔ)充NaCl的培養(yǎng)物顯示出特定mAb生產(chǎn)力的增加，這與滲透壓值呈正相關(guān)，而添加補(bǔ)料C的培養(yǎng)物在三種不同的滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）值之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。這可能源于后一種培養(yǎng)物由于葡萄糖豐度高，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用效率較低。此外，470 mOsm kg?1 NaCl和410 mOsm kg?1補(bǔ)料C培養(yǎng)物在第6天后表現(xiàn)出明顯更大的細(xì)胞直徑，如圖2C所示。

兩種高滲誘導(dǎo)方法對(duì)收獲時(shí)mAb糖基化的影響如圖6所示。在添加NaCl的培養(yǎng)物中，聚糖分布沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異（p>0.05）。然而，添加更多補(bǔ)料C的培養(yǎng)物顯示，隨著滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）的增加，G0F下降（410和500 mOsm kg?1之間的差異為18%）。這伴隨著G0的增加（410和500 mOsm kg?1之間的差異為10%）和半乳糖基化百分比的較小增加（G1F、G10F和G2F）。然而，毫不奇怪，表現(xiàn)出最高物種生產(chǎn)力（410 mOsm kg?1補(bǔ)料c）的培養(yǎng)物也顯示出非半乳糖基化的百分比增加。另一方面，抗體合成和分泌的高速率可能限制了抗體在高爾基體中的停留時(shí)間，因此降低了負(fù)責(zé)mAb半乳糖基化的b-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（b4GalT）對(duì)聚糖的進(jìn)一步加工程度。與預(yù)期的非半乳糖基化結(jié)構(gòu)的分布增加相反，核心巖藻糖基化在培養(yǎng)物中表現(xiàn)出意想不到的行為，包括添加補(bǔ)料C以調(diào)節(jié)滲透壓。如圖6所示，最高滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）條件（500 mOsm kg?1補(bǔ)料C）的核心巖藻糖基化水平明顯低于410 mOsm kg?1補(bǔ)料C樣品（p<0.05），盡管其特異性抗體生產(chǎn)率較低。上述觀察結(jié)果可能表明，由于較高的滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）水平，a-1,6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（FucT）酶活性受到抑制或基因（Fut8）表達(dá)減少，假設(shè)核心巖藻糖化的共底物GDP巖藻糖的水平不受滲透壓變化的影響。

三、高滲透壓對(duì)細(xì)胞體積的影響

在研究了CHO細(xì)胞培養(yǎng)開始時(shí)添加補(bǔ)料和鹽誘導(dǎo)的高滲性的影響后，我們?cè)谏锓磻?yīng)器中觀察了一組典型的補(bǔ)料CHO細(xì)胞。后者更好地代表了典型的生產(chǎn)條件，在這種條件下，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的補(bǔ)充和代謝物的產(chǎn)生，細(xì)胞外滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）比初始值增加了70%，此前有報(bào)道稱，這會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞體積增加四倍。此外，在生物反應(yīng)器環(huán)境中，我們可以有效地控制培養(yǎng)物的pH，但也可以探索在指數(shù)生長(zhǎng)期間將溫度轉(zhuǎn)移到溫和低溫條件的影響，這是延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間和提高產(chǎn)品滴度的常用策略。在我們的生物反應(yīng)器研究中，代謝在36.5℃時(shí)更活躍、 其中葡萄糖和乳酸兩者比在亞低溫下更容易被消耗。這導(dǎo)致滲透壓摩爾濃度在36.5時(shí)緩慢增加，用于相同的補(bǔ)料計(jì)劃（圖7a）。將平均細(xì)胞大小繪制為滲透壓濃度的函數(shù)，說明了滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）濃度對(duì)細(xì)胞體積的影響（圖7b）。

結(jié)果

在CHO細(xì)胞的Fed-Batch培養(yǎng)模式下，補(bǔ)料的添加和代謝產(chǎn)物的積累導(dǎo)致后期培養(yǎng)液物中細(xì)胞外滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）的增加。
通過NaCl調(diào)節(jié)滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）至470 mOsm/kg時(shí)對(duì)抗體產(chǎn)率和滴度具有促進(jìn)作用，但是通過補(bǔ)加Feed C提高了mAb產(chǎn)率，但細(xì)胞生長(zhǎng)速率顯著降低且導(dǎo)致半乳糖基化水平比例顯著降低。

3、結(jié)論

在本研究中，我們檢測(cè)了高滲條件對(duì)CHO細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞體積和抗體產(chǎn)生的影響。我們比較了兩種誘導(dǎo)高滲性的方法，添加NaCl和添加補(bǔ)料C。滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和抗體滴度的影響程度差異很大，取決于滲透壓的值以及增加滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）的方法。這是因?yàn)�，盡管高滲條件在所有條件下都提高了特定抗體的生產(chǎn)力，但它們也對(duì)生長(zhǎng)產(chǎn)生了不利影響，這意味著在某些情況下總滴度低于對(duì)照。令人驚訝的是，與補(bǔ)充補(bǔ)料C的培養(yǎng)物相比，補(bǔ)充NaCl的培養(yǎng)物表現(xiàn)出更一致的行為，這表明過量營(yíng)養(yǎng)物添加對(duì)生長(zhǎng)速率的不利影響。